ABSTRACT
Abstract To investigate osteoclast formation in vivo and if leukotriene B4 (LTB4) loaded in microspheres (MS) could be used as a therapeutical strategy to promote a sustained delivery of the mediator and prevent osteoclast differentiation. Methods: In vivo, apical periodontitis was induced in mice to investigate osteoclast differentiation and signaling in absence of 5-lipoxygenase (5-LO). In vitro, LTB4-MS were prepared using an oil-in-water emulsion solvent extraction-evaporation process. Characterization and efficiency of LTB4 encapsulation were investigated. J774A.1 macrophages were cultured in the presence of monocyte colony-stimulating factor (M-CSF) and ligand for receptor activator of nuclear factor kappa B (RANKL) and then stimulated with LTB4-MS. Cytotoxicity, in vitro MS-LTB4 uptake, osteoclast formation and gene expression were measured. Results: We found that 5-LO negatively regulates osteoclastic formation in vivo during apical periodontitis development. In vitro, LTB4-MS were up-taken by macrophages and were not cytotoxic to the cells. LTB4-MS inhibited osteoclast formation and the synthesis of osteoclastogenic genes Acp5, Mmp9, Calcr and Ctsk. LTB4-MS inhibited differentiation of macrophages into an osteoclastic phenotype and cell activation under M-CSF and RANKL stimulus.
Resumo O objetivo deste trabalho foi Investigar a formação de osteoclastos in vivo e se o leucotrieno B4 (LTB4) incorporado em microesferas (MS) poderia ser usado como estratégia terapêutica para promover uma entrega sustentada do mediador e prevenir a diferenciação dos osteoclastos. Métodos: In vivo, a periodontite apical foi induzida em camundongos para investigar a diferenciação e sinalização de osteoclastos na ausência de 5-lipoxigenase (5-LO). In vitro, LTB4-MS foi preparado usando um processo de evaporação e extração de solvente de emulsão de óleo em água. A caracterização e a eficiência do encapsulamento do LTB4 foram investigadas. Macrófagos J774A.1 foram cultivados na presença de fator estimulador de colônia de monócitos (M-CSF) e ligante para o receptor ativador do fator nuclear kappa B (RANKL) e, então, estimulados com LTB4-MS. Citotoxicidade, captação in vitro de MS-LTB4, formação de osteoclastos e expressão gênica foram avaliadas. Resultados: A via 5-LO regula negativamente a formação de osteoclastos in vivo durante o desenvolvimento da periodontite apical. In vitro, LTB4-MS foram fagocitadas pelos macrófagos e não foram citotóxicos para as células. LTB4-MS inibiu a formação de osteoclastos e a síntese dos genes pró-osteoclastogênicos Acp5, Mmp9, Calcr e Ctsk. Conclusões: LTB4-MS inibiu a diferenciação de macrófagos em um fenótipo osteoclástico e a ativação celular sob estímulo de M-CSF e RANKL.
ABSTRACT
Abstract Papain-based gel is used for chemical-mechanical caries removal and present antimicrobial and anti-inflammatory activities. However, its effects on dental pulp cells and on macrophages remains largely unknown. Therefore, the aim of this study was to investigate whether the papain-based gel Papacárie Duo® acts as an immunomodulator in lipopolysaccharide (LPS)-activated macrophages and its effects on dental pulp cells . J774.1 macrophage and OD-21 dental pulp cells were stimulated with 0.5% and 5% of Papacárie Duo®, following pre-treatment or not with LPS. After 24 h, a lactate dehydrogenase assay was used to measure cytotoxicity, a tetrazolium-based colorimetric assay (MTT) was used to measure cell viability, and qRT-PCR was used to analyze relative gene expression of Ptgs2, Il10, Tnf, Mmp9, Runx2, Ibsp and Spp1. Papacárie Duo® was cytotoxic and reduced cell viability at 5% but not at 0.5% in both cultures. In macrophages, Papacárie Duo® increased the expression Il10 and LPS-induced Ptgs2, but it did not affect Tnf or Mmp9. In OD-21 cells, Papacárie Duo® inhibited Runx2 and Ibsp expression, but stimulated Spp1 expression. Papain-based gel presented a concentration dependent cytotoxicity, without affecting cell viability, for dental pulp cells and macrophages. Interestingly, the gel presented an inhibitory effect on pulp cell differentiation but modulated the activation of macrophages stimulated with LPS. We speculate that in dental pulp tissue, Papacárie Duo® would impair reparative dentinogenesis but could activate macrophages to perform their role in defense and inflammation.
Resumo O gel à base de papaína é utilizando para remoção químico-mecânica do tecido cariado e apresenta propriedades antimicrobianas e anti-inflamatórias Entretanto, seu efeito sobre as células da polpa dentárias e macrófagos é desconhecido. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito de um gel de papaína (Papacárie Duo®) em células indiferenciadas da polpa dentária e a capacidade de induzir a ativação e síntese de mediadores inflamatórios por macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS). O gel de papaína foi diluído nas concentrações de 0,5 e 5%. Células indiferenciadas da polpa dentária OD-21 e macrófagos J774.1 foram mantidos em cultura com os diferentes estímulos por um período de estimulação de 24 h para realização do teste de citotoxicidade (Ensaio LDH) e para avaliação da viabilidade celular (Ensaio Colorimétrico MTT). A seguir foi realizada avaliação da expressão gênica relativa dos genes Ibsp, Runx2 e Spp1 em células OD-21; e dos genes Il10, Mmp9, Ptgs2 e Tnf em células J774.1, pelo método de transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR), após estimulação pelo período de 24 h. O extrato do gel diluído a 5% foi citotóxico às células da polpa dental, reduziu a viabilidade celular, inibiu a expressão de Runx2 e Ibsp e estimulou a expressão de Spp1. Em macrófagos, o extrato do gel foi citotóxico e reduziu a viabilidade celular na concentração de 5%. O LPS inibiu a viabilidade celular na presença ou não do extrato do gel, sem apresentar citotoxicidade. O extrato do gel induziu a expressão de Ptgs2 e Il10, sem alterar Tnf e Mmp9. O extrato do gel de papaína foi citotóxico, dependente da concentração, tanto em células da polpa dentária como em macrófagos, sem alterar a viabilidade celular. Interessantemente, apresentou efeito inibitório na diferenciação de células da polpa dentária e modulou a ativação de macrófagos estimulados com LPS. No tecido pulpar, o Papacárie Duo® poderia impedir a dentinogênese de reparação, porém ativar macrófagos para desempenhar seu papel na inflamação e defesa.